プロテオームとメタボロームを組み合わせた解析により、マイクロRNAについての洞察が得られます

Aug 02, 2023

寄生虫とベクター 16 巻、記事番号: 271 (2023) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

病原性ウイルスは、脊椎動物からの血液ミールの獲得中に雌のネッタイシマカ（Ae. aegypti）の蚊によって伝播する可能性があります。蚊および中腸に特異的なマイクロRNA (miRNA) 1174 (miR-1174) のサイレンシングにより、血液摂取が損なわれ、死亡率が増加します。 miR-1174の枯渇に応答するタンパク質と代謝産物の正体を解明することで、蚊の吸血と栄養代謝の制御におけるこのmiRNAの分子機構についての理解が深まるだろう。

アンチセンスオリゴヌクレオチド (アンタゴミア [Ant]) Ant-1174 および Ant-Ct を女性の Ae に注射しました。ネッタイ蚊は閉鎖後 12 ～ 20 時間で観察され、逆転写定量的リアルタイム PCR (RT-qPCR) によって miR-1174 の枯渇が確認されました。 Ant-1174 を注射した蚊と対照の蚊は、タンデム質量タグに基づくプロテオミクス分析および液体クロマトグラフィー - タンダム質量分析による非標的メタボローム解析のために注射後 72 時間の採血前に採取され、それぞれ発現差の異なるタンパク質と代謝物を同定しました。二本鎖 RNA (dsRNA) 注入を使用する RNA 干渉 (RNAi) を適用して、これらの差次的に発現される遺伝子の生物学的役割を調査しました。 RNAi 効果は、RT-qPCR およびウェスタンブロッティングアッセイによって検証されました。トリグリセリド含有量およびATPレベルは、製造業者の指示に従って、適切なアッセイキットを使用して測定されました。統計分析は、GraphPad7 ソフトウェアを使用し、Student の t 検定を使用して実行されました。

蚊および中腸特異的な miR-1174 を枯渇させると、合計 383 個の発現差のあるタンパク質 (DEP) が同定され、そのうち 258 個が上方制御され、125 個が下方制御されました。遺伝子オントロジー (GO) および京都遺伝子・ゲノム百科事典 (KEGG) 濃縮を使用したこれらの DEP の機能解析により、miR-1174 がアミノ酸代謝、ヌクレオチド代謝、脂肪酸代謝および糖代謝経路において重要な調節役割を果たしていることが示唆されました。合計 292 の異なる代謝産物が同定され、そのうち 141 が上方制御され、151 が下方制御されました。統合分析により、関連する異なるタンパク質と代謝産物が、解糖、クエン酸回路、酸化的リン酸化、アミノ酸代謝などのさまざまな代謝経路で主に豊富であることが示されました。具体的には、miR-1174枯渇蚊において上方制御されるタンパク質の1つであるプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP; AAEL002269）の遺伝子は、プリン、ピリミジン、ナイアシン-ニコチンアミドの代謝経路に関連していた。 PNP ノックダウンは血液消化と卵巣発育を著しく阻害し、成人死亡率を増加させました。機械的には、PNP の枯渇によりビテロゲニン遺伝子 (Vg) の有意な下方制御が引き起こされました。さらに、卵巣の発育に関連するエクジソンシグナル伝達経路およびインスリン様ペプチドシグナル伝達経路のいくつかの重要な遺伝子が影響を受けました。

この研究は、miR-1174 が枯渇した Ae におけるタンパク質と代謝物の異なる蓄積を示しています。プロテオミクスおよびメタボロミクス技術を使用したネッタイシマカの研究。この結果は、腸の生理活性における上方制御された遺伝子 PNP の役割についての機能的証拠を提供します。我々の発見は、miR-1174枯渇Aeにおける重要な分子変化を浮き彫りにしている。ネッタイシマカの研究は、蚊媒介細胞の系統特異的 miRNA に関与する分子機構の理解を深めるための基礎と新たな洞察を提供します。

媒介蚊のメスは、卵の発育に必要なアミノ酸やその他の栄養素を得るために脊椎動物から血液を採取します。したがって、それらは多数のウイルス病原体の媒介者として機能します。世界的な都市化と継続的な気候温暖化に伴い、蚊が媒介する病気のリスクが世界中で高まっており、公衆衛生に深刻な課題をもたらし、多くの国に多大な経済的負担を課しています[1]。ここ数年にわたり、遺伝子操作に基づいて蚊を媒介するウイルスを制御するための一連の有望な戦略と技術が受け入れられてきています[2、3、4、5]。しかし、効果的な医療介入が存在しないため、蚊が媒介するほとんどの病気の予防と制御は依然として制限されています。

1.2, as described in other studies [13,14,15,16] (Additional file 3: Table S3). The DEPs were subjected to GO enrichment [17] and KEGG pathway enrichment analyses [18]./p> 1 and P < 0.05 (unpaired two-sided Student’s t-tests) in the OPLS-DA model were considered to be differentially expressed metabolites (DEMs). Volcano plots and a hierarchically clustered heatmap were plotted to visualize significant features of the identified DEMs. Commercial databases, including KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) and MetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca/), were used for pathway enrichment analysis. Finally, integrated analysis of the proteome and metabolome was performed for the differential proteins and metabolites./p> 1.8 was considered to be satisfactory for subsequent experiments. The integrity of the extracted RNA was checked by 1% agarose gel electrophoresis. All primer pairs for the real time quantitative PCR (RT-qPCR) amplification of genes were designed using the software Primer Premier 5.0 and then synthesized at Sangon Biotech (Shanghai, China) (Additional file 7: Table S7). To examine the expression of the protein-coding genes, 1 µg of total RNA was reverse-transcribed into complementary DNA (cDNA) using the SuperScript™ IV First-Strand Synthesis System (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan). RT-qPCR was performed using TB Green Premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus; TaKaRa Bio Inc.). The reaction volume (20 µl) contained 10 µl of 2× NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus (Tiangen Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China), 0.8 µl of 10 µM primers, 0.4 µl ROX Dye II, 2 µl diluted cDNA and 6.8 µl ddH2O. Ribosomal protein S7 (RPS7; AAEL009496-RA) served as the internal control. Reactions were conducted on an ABI7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). The amplification procedure was: pretreatment at 95 °C for 1 min; followed by 40 cycles of 95 °C for 1 min and 60 °C for 1 min; ending with the generation of the dissolution curves at 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min and 95 °C for 15 s. To examine the expression level of miR-1174, 1 µg of total RNA was reverse-transcribed into cDNA using the SynScript® III miRNA RT SuperMix (TSK3001; Tsingke Biotechnology Co.,Ltd., Beijing, China). RT-qPCR was performed using a miRNA Universal SYBR qPCR Mix (TSE2001; Tsingke Biotechnology Co., Ltd.). The total reaction volume (20 µl) contained 10 µl of miRNA Universal SYBR qPCR Mix (Tsingke Biotechnology Co., Ltd.), 0.8 µl of 10 µM primers, 0.4 µl of 50× ROX Reference Dye II, 2 µl of diluted cDNA and 6.8 µl of ddH2O. Small nuclear RNA (snRNA) U6 (AAEL029000-RA) was used as the internal control. Reactions were conducted on the ABI7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) using the following amplification procedure: pretreatment at 95 °C for 1 min; followed by 40 cycles of 95 °C for 10 s and 60 °C for 30 s; ending with the generation of the dissolution curves at 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min and 95 °C for 15 s./p> 1.2, as used in other studies [13,14,15,16], we determined 383 DEPs, of which 258 were upregulated and 125 were downregulated (Fig. 1c; Additional file 8: Table S8). Hierarchical cluster analysis showed that these 383 DEPs were separated into upregulated and downregulated clades, and that the Ant-1174 group was differentiated from the control group (Fig. 1d); thus, miR-1174 depletion substantially caused a global protein expression response in mosquitoes./p> 1.2 or < 0.83, P < 0.05) illustrating the proteins differentially expressed between the Ant-1174 and control groups. The significantly upregulated differentially expressed proteins are shown in red, the significantly downregulated differentially expressed proteins are shown in blue and the proteins with no significant difference are shown in gray. d Hierarchical clustering analysis of the differentially expressed proteins visualized as a heatmap. The color blocks in different positions represent the relative expression of the corresponding proteins: red represents high expression and blue represents low expression. e Bubble chart showing GO enrichment of Ant-1174 vs Control. f KEGG pathways enriched by differentially expressed proteins between Ant-1174 and control group. Ant-1174/Ant-Ct, antisense oligonucleotides (antagomirs) Ant-1174/Ant-Ct; BP, biological Process; CC, cellular component; GO, Gene Ontology; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; MF, molecular function; miRNA-1174, microRNA-1174; PIJ, postinjection; WT, wild type/p> 1 and P value (in a Student’s t-test) < 0.05 yielded 292 differential metabolites, of which 141 were upregulated and 151 were downregulated (Fig. 2d; Additional file 9: Table S9). Hierarchical clustering analysis of these differential metabolites showed that samples of the same group were clustered in one clade and those of different groups were separated from each other (Fig. 2e; Additional file 10: Table S10). The upregulated metabolites could be divided into 10 super classes, of which the top five were organic acids and their derivatives; lipids and lipid-like molecules; organoheterocyclic compounds; organic oxygen compounds; and benzenoids (Fig. 2f; Additional file 11: Table S11). The downregulated metabolites could be divided into 11 super classes, of which the top five were organic oxygen compounds; organic acids and derivatives; lipids and lipid-like molecules; organoheterocyclic compounds; and nucleosides, nucleotides and analogs (Fig. 2f; Additional file 11: Table S11). In the super class organic acids and derivatives, 41 metabolites (76%) of POS mode and 24 metabolites (69%) of NEG mode belonged to the subclass amino acids, peptides and analogs. In the super class organic oxygen compounds, eight metabolites (62%) of POS mode and 29 metabolites (81%) of NEG mode belonged to the subclass carbohydrates and carbohydrate conjugates. We then performed a KEGG pathway enrichment analysis of these DEMs (Fig. 2g; Additional file 12: Table S12), which revealed that the DEMs were mainly enriched in the pathway aminoacyl-tRNA biosynthesis, followed by purine metabolism, glycerophospholipid metabolism, galactose metabolism, pyrimidine metabolism, glycine, serine and threonine metabolism, arginine and proline metabolism, pentose and glucuronate interconversions, alanine, aspartate and glutamate metabolism, cysteine and methionine metabolism, lysine degradation, amino sugar and nucleotide sugar metabolism, sphingolipid metabolism and glyoxylate and dicarboxylate metabolism./p>

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